The BioSkryb Advantage
PTA로 구동되는 ResolveDNA™는 현재 single cell에서 다른 모든 방법에 비해 월등한 whole genome amplification(WGA) 성능을 제공합니다.
• Single cell genomics에서 전례 없는 genome recovery(>95 %) 및 coverage uniformity을 갖습니다.
• 전례 없는 SNV calling sensitivity 및 specificity을 보입니다(SNV 민감도 76%, SNV 특이성 94%).
• 거의 전체의 genome을 복구할 수 있기 때문에, exome 또는 기타 targeted panel을 이용하거나 CNV 검출 등, 다양한 다운 스트림 분석을 수행할 수 있습니다.
• 기술의 특성상, primary template만 증폭에 사용하여 97% 이상 human reference genome에 mapping 되며, template이 없는 경우 증폭되지 않는 것이 특징입니다.
• 시퀀싱 데이터 결과의 재현성이 높습니다.
• Hands On Time 45 분으로 사용이 쉽고 편리합니다.
• Single Cell Genomics 분석 도구인 BaseJumper Bioinformatics Package를 제공하여, 데이터 품질을 평가하고 데이터에서 의미 있는 변이를 식별할 수 있도록 합니다.
The Technology
Primary Template-directed Amplification(PTA)은 single cell또는 ultra-low DNA input 샘플에 대한 새롭고 보다 정확한 whole genome amplification(WGA) 접근 방식으로, single cell genome variant calling metrics를 현재 방법들과 비교하여 차별화된 수준으로 높입니다.
영상을 통해 보다 정확하고 균일하며 재현 가능한 게놈 증폭을 생성하는 PTA 방법에 대한 세부 정보를 확인해 보세요.
WGA는 single cell 및 기타 미세한 생물학적 표본에서 게놈 분석을 수행할 수 있게 하는데, 이를 위해 일반적으로 사용되는
1. DOP-PCR(Degenerate Oligonucleotide-Primed PCR),
2. MDA(Multiple Displacement Amplification),
3. MALBAC(Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles)
4. LIANTI(Linear Amplification via Transposon Insertion)
와 같은 방법들은
1. 증폭 편향
2. 불량한 균일성
3. 오류 및 인공물
4. 낮은 게놈 적용 범위
5. 모든 변종 클래스를 처리할 수 없음
6. 낮은 정확도
7. 낮은 재현성
8. 자동화하거나 확장하기 어려운 복잡한 프로토콜
과 같은 단점이 있습니다.
PTA는 기존 접근 방식보다 통제되고 더욱 균일하고 정확한 방식으로, single cell의 genome의 >95%를 재현 가능하게 캡처하는 새로운 isothermal WGA 방법입니다. 이는 variant calling sensitivity와 specificity를 개선하고, 시퀀싱 비용을 낮추며, bioinformatic 분석을 용이하게 합니다.
PTA는 single cell WGS에서 우수한 coverage 와 uniformity를 제공합니다.
WGA를 PTA 기반 ResolveDNA™ WGA 키트(왼쪽)와 단일 세포 MDA(오른쪽)로 수행하여 비교해 보았습니다. 결과 그래프는 chromosome 1(100kb bins)의 일부를 보여줍니다. 두 방법 모두 커버되지 않은 중앙 영역은 centromere(동원체)에 해당합니다.
PTA는 아래의 다양한 single-cell genomics application을 가능하게 하는 핵심 기술입니다.
• single cells 및 sub-nanogram 샘플의 정확한 변이체 분석(SNP, indel, SNV 및 CNV)
• Minimal Residual Disease(MRD)의 감지 및 특성화
• Single cell resolution에서 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집의 정량적 게놈 전체 평가
• 희귀하고 배양 불가능한 미생물의 genome assembly 및 특성화
TA는 phi29 DNA polymerase의 장점인 공정성(processivity)과 strand displacement activity(가닥 치환 활성) 및 낮은 오류율을 이용합니다. 이러한 혁신적인 반응 설정은 exonuclease-resistant terminators를 사용하여 subsequent cycles of amplification에 대해 열악한 템플릿인 비교적 짧은, double-stranded amplification을 생성하는데, 이것이 반응을 exponential 에서 quasi-linear process(준선형 프로세스)로 변환하고, 그 과정에서 대부분의 amplicon이 primary template에서 생성됩니다. MDA와 달리 PTA는 프라이밍 및 증폭 편향, 대립 유전자 왜곡 및 daughter molecules(딸분자) 기타 오류의 기하급수적인 전파를 제한합니다. 그 결과 uniformity(균일성), coverage 및 reproducibility(재현성)이 향상되고 variant call rate가 크게 향상됩니다.
PTA 작동 방식.
PTA는 single cells(FACS, microfluidic 또는 기타 방법으로 채취), multiple cells 또는 극도로 낮은 DNA 입력(>4 pg-10 ng)에서 직접 수행할 수 있습니다. Denaturation 후 random primers(6-9-mer)가 어닐링됩니다. phi29 및 독점 뉴클레nucleotide pool로 확장하면 길이가 ~250~>1,500bp인 amplicon이 생성됩니다. 상대적으로 작은 이 amplicon들의 크기는 primary template의 subsequent 프라이밍을 선호하여 daughter molecules(딸분자)에서 바이어스 및 error의 기하급수적인 전파를 제한합니다. 또한 PTA chemistry는 chimeric molecules(키메라 분자) 및 비특이적 프라이밍과 같은 실험적 인공물의 형성을 억제합니다. PTA 반응 생성물은 double-stranded(이중 가닥)이며 fragmentation 없이 Illumina® 또는 기타 짧은 판독 플랫폼에서 multiplexed sequencing을 위한 라이브러리로 변환될 수 있습니다.
References:
1. Method for Nucleic Acid Amplification. WO/2019/148119.
2. Telenius H, et al. Genomics 1992;13(3): 718.
3. Dean FB, et al. PNAS 2002; 99(8): 5261.
4. Zong C, C et al. Science 2012; 338: 1622.
5. Chen C, et al. Science 2017; 356: 189.
6. Gonzalez, V et al. Manuscript in review.
Applications
BioSkryb 핵심 기술은 광범위한 single cell 및 및 ultra low input 애플리케이션을 지원합니다.
Cancer Genomics
Preimplantation Genetic Testing
Cardiology
Microbiome Research
Immunology
Bioprocessing
Neurology
Toxicology
Software: BioSkryb BaseJumper Bioinformatics Platform
BioSkryb BaseJumper Bioinformatics Platform Beta Version은 키트를 구매하거나 BioSkryb의 서비스를 사용하는 모든 고객에게 제공되는 무료 SW입니다. Human cells에 대한 표준 분석의 모든 단계를 수행하고 결과 데이터를 탐색할 수 있습니다. 사용자는 이를 이용하여 single cell datasets를 탐색하거나 custom workflow로 적용을 위해 정렬된 데이터를 다운로드할 수 있습니다.
BaseJumper 플랫폼은 bioinformatic DNA 시퀀싱 분석에 대한 표준화된 best practices를 사용하여 사용자가 sequencing alignment, coverage, 그리고 single nucleotide variant calling metrics를 포함하여 데이터 품질을 평가할 수 있도록 합니다. 분석 플랫폼의 베타 버전은 또한 직관적인 레이아웃으로 결과를 시각화하여 사용자가 셀(또는 샘플) 간의 결과를 비교할 수 있도록 합니다.
베타 버전은 Illumina, MiSeq, MiniSeq, NextSeq 및 NovaSeq 플랫폼과 호환됩니다. 향후 버전은 추가 유형의 genomic variants(structural 및 copy number variants)의 호출 및 시각화와 multi-omics data 통합을 포함할 것입니다.
