Claret Bioscience

왜 '짧은 cfDNA fragments'와
그 '말단'에
주목해야 할까요?

좋은 이야기는 시작, 중간, 끝으로 구성되어 있지만, 현재의 상업용 library prep. kit들은 전체 그림을 제공하지 않고, 바로 이야기의 중간 지점으로만 뛰어듭니다.
시작과 끝 부분의 내용이 중요하지 않아서 그런 걸까요?

체액에서 순환하는 cfDNA는 최소한의 침습적인 샘플링을 통해 얻어진 후 NGS(Next-generation Sequencing) 분석을 통해 질병 상태에 대한 풍부한 정보를 제공합니다. 

Figure 1에서 볼 수 있듯, cfDNA는 무작위적이지 않게 절단되어 보이는 주요한 뉴클레오솜의 흔적(footprints)(~167bp)으로, 전사(transcription) 인자 및 DNA 결합 단백질 복합체(~30-100 bp)와 같은 더 작은 생물학적 구조로 보호되는 영역도 관찰됩니다. 

cfDNA 단편 말단의 지놈 상의 위치 정보는 종양 기원 조직의 바이오 마커로서 그 잠재적 유용성이 점점 더 높이 평가되고 있습니다. 하지만 Double-stranded DNA library prep. kit 들은 native말단이나 더 작은 cfDNA fragments를 캡처하도록 설계되지 않았습니다.

Figure 1. cfDNA protection model((Snyder et al, 2016. Cell 164, 57–68에서 적용)

SRSLY의 WORKFLOW는 얼마나 간단한가요?

SRSLY WORKFLOW는 2.5 시간 미만 소요됩니다.

Figure 2. SRSLY WORKFLOW 소요 시간은 2.5 시간 미만입니다.

여러분이 사용하고 계시는 Library의 성능은 어떻습니까?

건강한 사람으로부터 2 개의 cfDNA 시료(샘플 1, 샘플 2)을 얻어 세 개의 상용 NGS 키트와 SRSLY 성능을 비교했습니다. 결과는 SRSLY metrics가 일반적으로 사용되는 키트에 대해 경쟁력이 있고, 오히려 그 성능을 압도한다는 것을 보여줍니다.
SRSLY는 일반적인 dsDNA prep.보다 더 짧은 fragments를 많이 회수하고, 타사의 ssDNA prep 방식에서 필수적으로 진행되었던 ~10bp의 데이터 Trimming을 진행할 필요가 없어 최종 데이터의 추가 손실 없이 DNA정보를 유지합니다(Swift Biosciences 기술 자료: Accel-NGS 1S Plus 및 Methyl-Seq Tail Trimming).

Figure 3. SRSLY 외 3개 사에 의해 캡처된 cfDNA 분자의 크기 분포 비교.
SRSLY는 short fragments의 최대 캡처를 보여줍니다.

Table 1. 라이브러리 수율 및 시퀀싱 데이터 비교

극소량의, 민감한 cfDNA에서
과연 유의미한 것들을 찾아낼 수 있을까요?

SRSLY(Single Reaction Single-stranded LibrarY) kit을 사용하면, DNA end repair 과정 없는 신속한 library prep.을 통해

• 높은 효율의 ligation

• 더 넓은 범위의 분자 회수

• Native ends의 retention

등이 가능해집니다.

SRSLY Kit은 극소량의 input DNA (100 pg – 2 ng) 사용으로 복잡한 라이브러리를 생성하도록 엔지니어링 된 라이브러리 prep.으로, 다양한 형태의 핵산 상태(duplexed, nicked, 또는 single-stranded)를 모두 회수할 수 있으며, 가장 짧은 fragments도 최종library에 포함되도록 합니다.

기존 dsDNA Library prep. 을 사용할 경우 어떤 것들이 손실될까요?

Table 2. 'SRSLY 및 기타 ssDNA library prep' vs 'dsDNA library prep'

새로운 Single-Stranded 접근 방법은
library prep.을 어떻게 개선하나요?

초기에 ancient DNA 용으로 개발된 NGS library prep 기술인 single-stranded 접근 방식은 극소량의 input DNA를 처리할 수 있습니다. 기존 dsDNA library prep 방법에 비해 짧고 성능이 저하된 DNA fragment의 회수율을 개선하여 library 복잡도와 수율을 높입니다. 따라서 cfDNA 및 FFPE와 같은 기타 손상도가 높은 임상 샘플에 이상적입니다. Single-Stranded 접근 방법은 더 짧은 fragments를 캡처하는데, 특별히 SRSLY Kit의 경우, End Repair 과정 없이 native ends정보를 직접 분석할 수 있기 때문에, 개선된 fragmentomic 분석 및 임상적 유용성을 위해 지놈 상의 좌표를 보다 정확하게 결정할 수 있는 정보를 얻을 수 있습니다.

Data는 무엇을 보여주나요?

SRSLY는 뉴클레오솜 위치 및 전사(transcription) 인자 binding의 분석을 원활하게 합니다.

Figure 4. 뉴클레오솜(long) 및 전사(transcription) 인자(short) 크기의 fragments 분석(WPS score 방법 및 Snyder et al, 2016. Cell 164, 57-68의 예상 분포 데이터).

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